Publicación Actual No. 16

Radiación láser pulsada revela la dinámica del ADN en tiempo real




La naturaleza microscópica de la materia a nivel molecular no es la única dificultad que enfrentamos para el estudio de sus fenómenos a esta escala. Resulta que, precisamente debido a las distancias involucradas, los fenómenos a este nivel ocurren en tiempos en suma breves. Dicha escala temporal puede estimarse considerando el hecho de que el movimiento vibracional en moléculas y sólidos se lleva a cabo con velocidades hasta del orden de 10 km/s, involucrando distancias de tan sólo unos angstroms, con lo cual el registro directo de eventos de transformación molecular requiere de una resolución temporal del orden de los femtosegundos (10-15) y attosegundos (10-18) [1].

Gracias a los desarrollos en la generación de luz pulsada que se han dado durante las últimas dos décadas, hoy en día es posible hacer observaciones directas de la dinámica de ruptura y formación de enlaces químicos, así como de los cambios de configuración electrónica que son la esencia de los fenómenos de transformación de la materia. Como se verá más adelante, esto ha permitido comprender la complejidad real tanto de procesos químicos como biológicos; e incluso, ha sido fuente de inspiración en el diseño de nuevos compuestos y materiales [2]. La esencia de muchos de los experimentos en esta área descansa en la idea de iniciar un proceso de transformación al hacer incidir sobre la muestra un pulso láser de inicio (comúnmente conocido como pulso de “bombeo”) y de seguir los cambios inducidos mediante mediciones espectroscópicas que requieren de uno o más pulsos ópticos consiguientes; éstos atraviesan la muestra después de un tiempo de evolución bien conocido, que también puede ser controlado con resolución del orden de la duración de los pulsos.

El avance más importante para la generación de pulsos luminosos con duración ultracorta (del orden de 10-15 s) consistió en el diseño de cavidades ópticas, donde fue posible fijar la relación de fases entre los modos longitudinales de un láser de Titanio: Zafiro, incluyéndose un ancho de banda de hasta decenas de nanómetros alrededor de la longitud de onda central de 800 nm (fenómeno conocido como de amarre de modos o “modelocking”) [3]. Tales diseños permitieron generar secuencias de pulsos con duración de menos de 10 femtosegundos, pero con energía de tan sólo unos cuantos nanojoules. Para lograr las intensidades necesarias en aplicaciones experimentales, el desarrollo anterior fue complementado con técnicas de amplificación por el método de dispersión-amplificación-re-compresión (“chirped pulse amplification”), según el cual, el pulso es alargado temporalmente antes de su amplificación y, más tarde, recomprimido a su duración original. Nótese que el alargamiento temporal reversible es esencial para poder amplificar pulsos ópticos al nivel de varios milijoules [4]. Finalmente, la aplicación de estos pulsos a las diferentes situaciones experimentales requiere de la transformación de su frecuencia, para lo cual ha sido esencial la aplicación de múltiples técnicas de óptica no lineal, gracias a las que es posible contar con fuentes pulsadas en prácticamente cualquier región del espectro electromagnético [5]. Es importante resaltar que a pesar de que hoy en día se pueden hacer mediciones espectrales desde la zona del ultravioleta hasta el infrarrojo lejano, la fuente inicial sigue siendo, en la mayoría de los casos, un oscilador óptico de Titanio:Zafiro que opera alrededor de 800 nm, y cuyos pulsos son transformados de múltiples maneras para las diferentes mediciones.

Para mostrar la versatilidad de las técnicas espectroscópicas modernas, nos enfocaremos en una línea de investigación reciente: Se presenta a continuación el estado del arte en las exploraciones sobre la evolución de los estados electrónicamente excitados de los componentes del ácido desoxirribonucleico (ADN).

La Fotofísica del ADN

El estudio por espectroscopia ultrarrápida de las bases nitrogenadas que conforman el ADN (adenina, timina, guanina y citosina), ha revelado que estas moléculas cuentan con propiedades insospechadas con anterioridad y que, al menos en parte, explican las razones por las cuales fueron evolutivamente seleccionadas durante el desarrollo de los sistemas biológicos más primitivos.

La luz solar es esencial para la vida en la tierra ya que gracias a ella se dan los procesos fotosintéticos y se estabiliza la temperatura terrestre. A pesar de esto, los fotones que recibe la tierra incluyen radiación con longitudes de onda en el ultravioleta (λ < 400 nm), la cual es altamente dañina por su alta capacidad para inducir transformaciones fotoquímicas degradativas. De hecho, fue durante las primeras etapas de la evolución química y biológica, cuando la densidad de radiación UV en la superficie terrestre alcanzó su grado máximo, dado que no fue sino hasta la generación indirecta de la capa de ozono por las plantas primitivas, que esta región del espectro pudo ser filtrada por las capas superiores de la atmósfera [6]. La gran densidad de esta radiación aparentemente desencadenó una “selección natural fotoquímica” de la cual, al parecer, las bases del ADN sobrevivieron gracias a sus mecanismos fotofísicos, que las vuelven intrínsecamente fotoestables, según se descubrió mediante técnicas de espectroscopía ultrarrápida según se relata a continuación.

A principios de la década pasada, algunos grupos de investigación decidieron estudiar la dinámica resultante de la absorción de luz UV por las diferentes bases nitrogenadas; esto requirió de la adaptación de diversas técnicas de espectroscopia ultrarrápida, a la zona del UV [7,8]. Los experimentos se realizaron de la siguiente manera: se hizo incidir un pulso de luz UV (266 nm, 10 fs) en muestras de nucleósidos en solución acuosa, que lleva a las moléculas a estados electrónicamente excitados (estados S1). En general, las moléculas orgánicas que han sido llevadas a tales estados o configuraciones electrónicas son sumamente reactivas, debido a que, en presencia de otros compuestos, existen reacciones de transferencia de electrones que dan origen a especies radicalarias (aniónicas y catiónicas), las cuales, a su vez también son sumamente reactivas. La evolución de las moléculas en este estado se detectó mediante otros pulsos de luz que indujeron transiciones consiguientes (S1 → Sn), y cuya señal de absorbancia óptica indicó la población de moléculas que aún existían en el estado originalmente formado. Existe otro tipo de experimentos con los que se detectaron con resolución de femtosegundos a los fotones que son emitidos de manera espontánea desde el estado S1[9]. Esto se logró al hacer interactuar a los fotones emitidos con fotones de un pulso de medición (frecuentemente llamado pulso de “compuerta”), lo cual redunda en señales sobre la intensidad de emisión en función del tiempo. Ambos tipos de experimentos pueden ser interpretados para medir el tiempo que las moléculas fotoexcitadas permanecen en el estado S1. Para sorpresa de los investigadores, este tipo de experimentos reveló que, a diferencia de la gran mayoría de las moléculas orgánicas, los nucleósidos decaen del estado S1 en tiempos de tan sólo algunos cientos de femtosegundos [6,10].

Asimismo, en una nueva serie de experimentos fue posible determinar que la población de moléculas en el estado S1 decaía a la par que recuperaba la población del estado electrónico basal (estado de origen, antes de la excitación), con lo que el sistema regresa a su situación de equilibrio en tiempos del orden de 10-13 segundos y donde la energía inicialmente absorbida se disipa en forma de colisiones con el disolvente acuoso. El fenómeno de relajación y las observaciones experimentales respectivas se resumen en la Figura 1. Es muy importante subrayar que este comportamiento es muy diferente al de la gran mayoría de los cromóforos, los cuales permanecen electrónicamente excitados en el estado S1 por varios nanosegundos.

Figura 1. Figura tomada de: C.T. Middleton, K. de La Harpe, C. Su, Y.K. Law, C.E. Crespo-Hernandez and B. Kohler Annual Review of Physical Chemistry 60 217 (2009). Figure 2. a, b.

(a) Gráfico superior: Señal de absorbancia transitoria del estado S1 como función del tiempo para 9-metiladenina en diversos disolventes. Gráfico inferior: Señales de absorbancia transitoria del estado electrónico basal para la misma molécula. Como se puede apreciar, la señal asociada a S1 (transiciones S1 → Sn , flecha color naranja en el diagrama (b)) decae en menos de 300 fs debido a la recuperación de la población del estado electrónico basal. Dicha recuperación es seguida por el enfriamiento vibracional del sistema en la escala de varios picosegundos en los diversos disolventes (retorno de la señal a la línea base en varios picosegundos).

(b) Diagrama que indica las transiciones involucradas en el proceso: (1) Absorción de luz UV para generar el estado S1 (π-π*). (2) Conversión S1 → estado electrónico basal. (3) Enfriamiento vibracional en el estado basal.

El fenómeno de relajación que fue descubierto por observaciones espectroscópicas ultrarrápidas, ha sido también estudiado mediante cálculos mecánico-cuánticos, los cuales permiten mapear las superficies de energía potencial de las moléculas en sus diversos estados electrónicos. Resultante de tales cálculos, hoy en día se ha esclarecido que el mecanismo de la relajación de los componentes está asociado a la existencia de las llamadas “intersecciones cónicas” entre las superficies de energía potencial del estado S1 y el estado basal. Las intersecciones cónicas son puntos o zonas en las superficies de energía potencial en las que ambos estados electrónicos tienen la misma energía. Debido a esto, cuando el sistema explora sus conformaciones nucleares en el estado S1, va a dar directamente a una especie de trampa energética en donde existe un muy fuerte acoplamiento entre el estado excitado y el basal. Esto último se traduce en una evolución del sistema hacia la superficie del estado basal [11]. Una vez que ha sucedido esto, la molécula puede perder su exceso de energía (originalmente energía electrónica) mediante interacciones con el disolvente que la rodea. De nuevo, vale la pena resaltar que el mecanismo aquí descrito, presente en los constituyentes del ADN, no se encuentra frecuentemente en la mayoría de las moléculas orgánicas, indicándo que muy probablemente existieron mecanismos evolutivos que seleccionaron a las cuatro bases: adenina, timina, citosina y guanina, para conformar nuestro material genético.

Referencias.

[1] A.H. Zewail Angew. Chem., Int. Ed. 39, 2586, (2000)

[2] A.H. Zewail Chem. Phys. 378, 1, (2010)

[3] D.E. Spence, P.N. Kean and W. Sibbett Optics Lett. 16, 42, (1991)

[4] S. Backus, C.G. Durfee, III, M.M. Murnane and H.C. Kapteyn Review of Scientific Instruments 69, 1207, (1998)

[5] K.R. Wilson and V.V. Yakovlev J. Opt. Soc. Am. B 14, 444, (1997)

[6] C.T. Middleton, K. de La Harpe, C. Su, Y.K. Law, C.E. Crespo-Hernandez and B. Kohler Ann. Rev. Phys. Chem. 60, 217, (2009)

[7] J.M.L. Pecourt, J. Peon and B. Kohler J. Am. Chem. Soc. 123, 10370, (2001)

[8] P.M. Hare, C.E. Crespo-Hernandez and B. Kohler Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 435, (2007)

[9] J. Peon and A.H. Zewail Chemical Physics Letters 348, 255, (2001)

[10] J.M.L. Pecourt, J. Peon and B. Kohler J. Am. Chem. Soc. 122, 9348, (2000)

[11] L. Serrano-Andres and M. Merchan J. Photochem. Photobiol., C 10, 21, (2009)










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