Publicación Actual No. 16

Optogenética y proteínas fluorescentes: induciendo, silenciando e iluminando la actividad celular.




Optogenética: La Nueva Revolución Biofísica.

A finales del año pasado, la prestigiosa revista Nature seleccionó como el método experimental del año a la técnica conocida hoy en día como Optogenética (Optogenetics). Tal distinción no es de ninguna manera trivial ni azarosa. La optogenética iniciada hace aproximadamente una década, ha demostrado ya dejar de pertenecer a la ciencia ficción para insertarse monumentalmente como una técnica experimental perfectamente plausible y que está iniciando indudablemente la siguiente revolución en nuestra comprensión de los delicados mecanismos biológicos que dirigen y forman la complejidad de los seres vivos.

En esencia, la optogenética es una técnica experimental que, mediante la inserción de genes específicos, permite la expresión de proteínas sensibles a distintas longitudes del espectro electromagnético en el interior de una célula, pudiendo modificar y vigilar el comportamiento y dinámica de algunas componentes de la maquinaria celular. Uno de los ejemplos más concretos y en el cual se ha reportado un mayor éxito es la modificación del potencial electrostático en la membrana celular de células excitables como es el caso de las neuronas, las células del músculo cardiaco y células β en los tejidos del páncreas que controlan la liberación de insulina [1]. En las neuronas, por ejemplo, la depolarización e hiperpolarización de la membrana celular da origen a la activación o inhibición de las señales eléctricas (spiking) que dan origen a la comunicación interneuronal. De forma entonces que controlando la depolarización o hiperpolarización de la membrana neuronal es posible inducir o inhibir la frecuencia de disparo y por tanto, la funcionalidad y comunicación de estas neuronas con sus vecinas.

A fin de hacer funcionar esta técnica se requieren proteínas que puedan funcionar como interruptores de los canales iónicos que inducen la polarización, en un sentido u otro, de la membrana celular. Mucho se discutió en su momento sobre la factibilidad ya sea de hallar este sistema en la Naturaleza o de nuestra capacidad para generarlo mediante ingeniería genética. Después de identificar una proteína con características similares en ciertas algas marinas y de cierta ingeniería genética se pudo concretar la síntesis de Channelrhodopsin-2 (ChR2), la primer proteína capaz de funcionar como interruptor de los canales iónicos de calcio, potasio y sodio que controlan los potenciales de acción (action potentials) en células excitables [2]. Cuando se expresa en una neurona y se expone a luz azul, la proteína depolariza la membrana celular forzando a la neurona a emitir una señal eléctrica (spike) [3].

Es posible también inhibir y reducir la frecuencia de disparo de las neuronas mediante la hiperpolarización de la membrana celular a través del acoplamiento de la proteína Halorhodopsina (NpHR) a la membrana celular. Al ser excitada por luz amarilla, la NpHR funciona como un interruptor que “abre” los canales de potasio permitiendo la liberación de iones K+ haciendo que el potencial electrostático de la membrana se haga más negativo [3]. En un estado de hiperpolarización, la frecuencia de spiking de las neuronas se hace mucho menor (Figura I).

Figura 1. Ilustración del acoplamiento de las proteínas ChR2 y NpHR a la membrana celular de una neurona y que permiten, mediante su activación por luz visible, inducir o inhibir la frecuencia de disparo (spiking) de una neurona. Figura tomada de la referencia [3].

Las posibilidades de la modificación de la frecuencia de respuesta de una célula excitable no sólo se han explorado en el campo de las neuronas. Recientemente, un grupo de investigadores en la Universidad de California, San Francisco, ha logrado inducir taquicardias, bradicardias e incluso paro cardiaco en las células cardiacas que controlan el latido del corazón en peces cebra (Danio rerio) mediante la expresión de proteínas de tipo interruptor canal iónico como las discutidas anteriormente, ChR2 y NpHR [4]. Los resultados de este estudio son notables. Es posible, por ejemplo, pasar de una condición de taquicardia (exceso de la frecuencia cardiaca) a una bradicardia, (descenso de la frecuencia a menos de 50 latidos /minuto) mediante la excitación de las proteínas con patrones de luz específicos. La especificad con que es posible “marcar” las células que se desean excitar o inhibir es también un elemento crucial que abre enormes posibilidades biomédicas en el tratamiento de enfermedades cardiacas actualmente intratables y degenerativas. Los resultados publicados por Arrenberg et al son en realidad los precursores del primer marcapasos óptico [4] de la era moderna.

Iluminando el Interior Celular. “Brainbow”.

En ocasiones no se desea modificar propiamente el comportamiento de una célula, sino sólo identificarla y monitorear su comportamiento durante un proceso bioquímico determinado. El descubrimiento de la proteína verde fluorescente, (GFP, por sus siglas en inglés) en organismos marinos bioluminiscentes, la identificación del gen responsable para la expresión de la proteína y las técnicas experimentales necesarias para su implantación en mamíferos llevó a Shimomura, Chalfie and Tsien a obtener el Premio Nobel de Química en 2008 [5] y llevaría el monitoreo de la actividad celular a una escala totalmente diferente.

GFP pertenece a una familia de proteínas fluorescentes denominadas FP’s caracterizadas por una masa molecular de 25 kDa formada por 220-240 aminoácidos agrupados en una estructura de barril compacta formada por 11 hojas β que encierran a una hélice en su interior. La hélice α contiene el grupo cromóforo formado por sólo tres aminoácidos en las posiciones 65, 66 y 67 que mediante un mecanismo de intercambio de protones es fluorescente en distintas regiones del espectro electromagnético. GFP, particularmente, muestra un pico de emisión máximo en la longitud de onda correspondiente al verde al ser excitada mediante luz azul o UV [6]. Esta propiedad y el hecho de que no requerir de co-factores adicionales para su excitación, hacen a GFP extremadamente interesante a fin de “marcar” a un grupo de células en específico mediante la clonación del gen correspondiente y su expresión dentro de la célula a marcar. Dicho en una frase parece trivial y simple, sin embargo tuvieron que pasar más de 40 años para que GFP pasara desde su identificación en la medusa marina Aequorea victoria a la identificación del gen correspondiente, su implementación en organismos procariotas y eucariotas y la observación por primera vez del interior de organismo multicelular [5].

El primer organismo superior en ser iluminado mediante la expresión de proteínas GFP fue el nematodo C. elegans, el cual al ser transparente facilita la visualización directa de la emisión de luz verde de las proteínas GFP [7]. En un trabajo espectacular que alcanza ya más de tres mil citas, Chalfie et al expresaron el gen que codifica a GFP en células eucariotas y procariotas, particularmente en los organismos E. coli y C. elegans [7]. En ambos casos, la proteína expresada mostró un alto grado de estabilidad alcanzado los 10 minutos de actividad fluorescente antes de ser degradada por la maquinaria celular. Tomando en cuenta que muchos procesos bioquímicos se desarrollan en una escala de tiempo dos o tres órdenes de magnitud menor, puede decirse que GFP es un excelente candidato para monitorear muchos procesos bioquímicos.

Figura 2. Expresión de la proteína GFP en la primera etapa larvar del nematodo C. elegans en dos células neuronales perfectamente identificadas, ALMR y PLMR. La línea delgada también iluminada muestra el nervio principal que conecta el sistema neuronal de C. elegans. Figura tomada de la referencia [7].

La explicación del mecanismo físico detrás de la fluorescencia de GFP y otras proteínas similares por Tsien [8] ha permitido generar una paleta muy vasta de proteínas que fluorescen en prácticamente todas las frecuencias del espectro visible. Particularmente es el caso de la familia de proteínas DsRed que tienen un pico de emisión en el rojo puesto es justo en esta longitud de onda que los tejidos de mamíferos presentan un menor grado de atenuación y absorción de la señal permitiendo una visualización más intensa y con menor interferencia.
En un trabajo publicado en Nature en 2007, Livet et al utilizaron tres proteínas fluorescentes XFP de la paleta de colores que emiten en el amarillo, cian y rojo expresándolas en el sistema neuronal de un ratón [9]. Las proteínas utilizadas son el equivalente al sistema de colores que permite iluminar los pixeles de una pantalla y generar toda una gama de colores. Esta técnica permite generar lo que se denominó brainbow, un mapa visual completo de las conexiones inter-sinápticas de la red neuronal. Mediante combinaciones adecuadas de esta paleta básica de colores, es posible representar hasta 90 tonalidades que pueden mapear distintos axones y conexiones inter-sinápticas.

Figura 3. Sección del cerebelo de un ratón en donde se han expresado las proteínas fluorescentes XFP que emiten en la paleta básica de colores amarillo, cyan y rojo. El corte comprende aproximadamente 341 axones y 93 células granulares. Tomada de la referencia [9].

Perspectivas.

Las posibilidades de la optogenética y las proteínas fluorescentes como inhibidores, activadores y monitores de la actividad celular está apenas iniciando. Los primeros experimentos muestran la viabilidad de la técnica, a la vez que sus limitaciones. Una de las mayores ventajas de la técnica es el hecho de que las proteínas XFP y los interruptores de canales iónicos Channelrhodopsina-2 y NpHR no requieren de otras enzimas o co-factores para expresarse adecuadamente, de forma entonces que su activación sólo se logra a través de la excitación por luz en la longitud de onda adecuada. Asimismo, hasta el momento ningún estudio parece mostrar evidencia de niveles de toxicidad para las células. En el lado de las desventajas existe una problemática no del todo resuelta: la estabilidad termodinámica de las proteínas. Los trabajos de Tsien mostraron que la actividad fluorescente está asociada principalmente al hecho de que el grupo cromóforo se halla “blindado” por las once hebras beta que forman el barril de GFP y que es típica de las proteínas fluorescentes. Al desnaturalizarse, sin embargo, el grupo cromóforo queda expuesta a las enzimas del medio celular, perdiéndose todo rastro de la actividad fluorescente. Es entonces de crucial importancia generar mutantes que al mismo tiempo de ser fluorescentes sean lo suficientemente robustas para evitar la desnaturalización en condiciones aún más extremas de pH y temperatura.

Las implicaciones biomédicas en el tratamiento de muchos padecimientos hoy intratables son fascinantes. Estudios recientes del padecimiento de Alzheimer identifican como un factor importante para la desincronización neuronal al flujo irregular de iones de Ca+2. Las proteínas del tipo Channelrhodopsin-2 y NpHR podrían ser los precursores del tratamiento optogénetico futuro de éste y otros padecimientos al poder ser controlados eventualmente con tal precisión que ciertos grupos de neuronas podrían ser silenciadas en tanto que otras podrían ser activadas con patrones específicos de luz. Por otro lado, patologías como taquicardias y bradicardias están también en el horizonte no lejano. Las siguientes décadas seguramente verán la explosión de estas técnicas hoy todavía en el laboratorio.

Referencias.

[1] Editorial and Primer. Nature Methods 8 (1), 25-25, (2011).

[2] Zhang F, Wang LP, Boyden ES and Deisseroth K. Nature Methods 3, 785, (2006).

[3] Deisseroth K. Nature Methods 8, 26, (2011).

[4] Arrenberg AB, Stainier DYR, Baier H and Huisken J. Science 330, 971, (2010)

[5] The Nobel Prize in Chemistry 2008. http://nobelprize.org

[6] Chudakov D M, Matz M V, Lukyanov S and Lukyanov K. A. Physiol Rev 90, 1103, (2010).

[7] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward W W. Science 263, 5148, (1994).

[8] Tsien R. Angew Chem Int Ed 48, 5612, (2009)

[9] Livet J, Weismann T A, Kang H, Draft R W, Lu J, Bennis R A, Sanes J R and Lichtman J W. Nature 450, 56, 2007.










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